介紹

干細(xì)胞是一群未分化的細(xì)胞，具有自我更新和重建功能組織的獨(dú)特能力。它們主要根據(jù)分化潛力、起源和譜系進(jìn)展進(jìn)行分類。

根據(jù)其效力，干細(xì)胞可以是全能的、多能的、專能的、寡能的和單能的。干細(xì)胞存在于胚胎和成體細(xì)胞中。胚胎干細(xì)胞 (ESC) 和誘導(dǎo)多能干細(xì)胞 (iPSC) 是多能干細(xì)胞的最佳例子，而成體多能干細(xì)胞的例子有造血干細(xì)胞 (HSC)、間充質(zhì)干細(xì)胞 (MSC)、神經(jīng)干細(xì)胞（NSC）和內(nèi)皮干/祖細(xì)胞（EPC）（圖1a）。所有這些干細(xì)胞亞型都已被廣泛試驗(yàn)用于治療人類疾病。

外泌體的產(chǎn)生和純化（MSC和NSC用作多能干細(xì)胞的例子）。b天然外泌體的含量。c外泌體修飾。（BM骨髓、DC樹突狀細(xì)胞、IAC免疫親和層析、iPSC誘導(dǎo)多能干細(xì)胞、MHC主要組織相容性復(fù)合物、miRNA microRNA、MSC間充質(zhì)干細(xì)胞、MVB多泡體、NSC神經(jīng)干細(xì)胞、SEC尺寸排阻層析、UC臍帶）

干細(xì)胞源性外泌體的臨床應(yīng)用

干細(xì)胞療法作為再生醫(yī)學(xué)的一種方式，引起了極大的關(guān)注，因?yàn)樗鼮榛加幸郧盁o法治愈的疾病的患者提供了新的選擇。隨后，數(shù)千項(xiàng)相關(guān)臨床試驗(yàn)被注冊，涵蓋廣泛的醫(yī)學(xué)問題，如肌肉骨骼和神經(jīng)系統(tǒng)疾病、免疫疾病、血液功能障礙和退行性疾病。然而，一些試驗(yàn)未能在臨床中顯示出任何益處。這可能是由于干細(xì)胞療法不可避免的局限性，例如輸注毒性、免疫原性、致瘤潛力和倫理問題。外泌體由包括干細(xì)胞在內(nèi)的幾乎所有細(xì)胞類型分泌（圖1a），已被認(rèn)為是干細(xì)胞治療的更安全、更通用的替代方案。

外泌體是納米級、球形、脂質(zhì)雙層單膜細(xì)胞外囊泡，充當(dāng)細(xì)胞間信使。外泌體被認(rèn)為是其親代細(xì)胞的微型版本，部分原因是來自某種細(xì)胞類型的外泌體提供了細(xì)胞特異性或獨(dú)特的生物分子組。此外，還發(fā)現(xiàn)干細(xì)胞通過其可溶性分泌體（包括外泌體）以旁分泌方式發(fā)揮作用。

換句話說，干細(xì)胞衍生的外泌體 (SC-Exo) 從其親本細(xì)胞繼承了類似的治療作用，例如抗炎、免疫調(diào)節(jié)和組織再生。總的來說，干細(xì)胞來源的外泌體是干細(xì)胞治療的有效替代品，且沒有表現(xiàn)出其細(xì)胞對應(yīng)物所存在的缺點(diǎn)（表1）。

在臨床應(yīng)用之前，必須在生產(chǎn)、純化和修飾方面制備和優(yōu)化外泌體（第2.3和2.4節(jié)）。近年來，發(fā)表了大量分析外泌體治療上游措施的醫(yī)學(xué)評論。然而，一些研究途徑仍然沒有得到充分研究：特別是缺乏致力于下游臨床應(yīng)用的系統(tǒng)研究，特別是從外科角度來看。無論是由于疾病還是外科醫(yī)生的手術(shù)刀而受損的組織，都會通過炎癥和再生動力學(xué)做出反應(yīng)，使手術(shù)成為干細(xì)胞衍生的外泌體治療的完美場所。干細(xì)胞衍生的外泌體從其親本細(xì)胞繼承了類似的治療作用，例如組織再生、抗炎和免疫調(diào)節(jié)。

在這項(xiàng)工作中，我們將剖析過去五年的相關(guān)出版物，以呈現(xiàn)全面的、最新的、針對特定專業(yè)和疾病的綜述（圖2）。我們的目標(biāo)是彌合外科醫(yī)生、納米醫(yī)學(xué)從業(yè)者和干細(xì)胞研究人員之間目前存在的差距。

外泌體的治療效果是通過疾病特異性組織反應(yīng)、組織特異性細(xì)胞改變和細(xì)胞特異性分子信號通路分層轉(zhuǎn)化而來的。

外泌體和外泌體治療的一般背景

外泌體的生物發(fā)生、組成和攝取

外泌體在大小、含量和產(chǎn)生機(jī)制方面不同于其他類型的初級細(xì)胞外囊泡（例如凋亡小體和微泡）。最普遍接受的外泌體形成機(jī)制，即內(nèi)體途徑，如下（圖1a）。初始內(nèi)體是通過細(xì)胞膜內(nèi)陷產(chǎn)生的，在此期間生物活性物質(zhì)開始在早期分選內(nèi)體中積累。晚期分選內(nèi)體在第二次壓痕后形成多泡體（MVB）。最后，MVB與細(xì)胞膜融合，將攜帶的外泌體釋放到外部。外泌體生物發(fā)生的非內(nèi)體途徑，例如質(zhì)膜出芽，也有報(bào)道。

正如三大外泌體數(shù)據(jù)庫（即ExoCarta、Vesiclepedia和EVpedia）所總結(jié)的那樣，外泌體含有眾多分子，包括蛋白質(zhì)、糖類、脂類、核酸、代謝物和其他生物活性物質(zhì)（圖1b）。一方面，外泌體由復(fù)雜的蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)組成，包括外部蛋白質(zhì)（如四泛蛋白、抗原遞呈復(fù)合物和粘附分子）和內(nèi)部蛋白質(zhì)（如熱休克蛋白、ESC）、另一方面，微小核糖核酸（mRNA）是人類外泌體核酸中含量最高的物質(zhì)，可通過外泌體介導(dǎo)的細(xì)胞通訊參與造血、外分泌以及神經(jīng)和血管再生。

一旦外泌體到達(dá)受體細(xì)胞，就會有多種攝取機(jī)制，所有這些都可以分為膜融合、受體相互作用和內(nèi)化（圖1b）。最后，外泌體貨物被釋放到細(xì)胞質(zhì)中，該過程取決于外泌體的來源、貨物的性質(zhì)以及受體細(xì)胞的代謝狀態(tài)。從外泌體生物發(fā)生到攝取和細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)的整個(gè)生命周期可以使用熒光、發(fā)光和放射性技術(shù)進(jìn)行跟蹤。

外泌體的來源和分類

根據(jù)外泌體是否經(jīng)過人工修飾，它們大致分為天然外泌體和工程外泌體（第2.4節(jié)）。根據(jù)來源物種的不同，外泌體分為動物源性外泌體和植物源性外泌體。

目前，外泌體主要根據(jù)其親代細(xì)胞的類型進(jìn)行分類。幾乎所有類型的人類細(xì)胞都可以產(chǎn)生外泌體。這些包括但不限于巨噬細(xì)胞、樹突細(xì)胞(DC)、血小板、干細(xì)胞、甚至腫瘤細(xì)胞 (圖1a)。

例如，巨噬細(xì)胞衍生的外泌體有助于疾病進(jìn)展（例如糖尿病、動脈粥樣硬化和心力衰竭）和疾病治療（例如皮膚傷口、炎癥性腸病以及真菌和病毒感染）。然而，它們在抑制和促進(jìn)腫瘤方面似乎發(fā)揮著矛盾的作用。與DC一樣，DC衍生的外泌體 (Dex) 也可以通過其表面蛋白（例如主要組織相容性復(fù)合物 (MHC)）與免疫細(xì)胞（例如T細(xì)胞、B細(xì)胞和NK細(xì)胞）相互作用。一些臨床前和臨床試驗(yàn)已經(jīng)證明了基于 Dex 的癌癥免疫療法的有效性和安全性。此外，腫瘤源性外泌體 (Tex) 不僅參與腫瘤增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移和免疫，還可以作為癌癥診斷和治療的生物標(biāo)志物。最近，Tex已被用作抗腫瘤藥物和DC疫苗接種的抗原呈遞物，成為一種有前途的無細(xì)胞癌癥免疫療法。

最后，干細(xì)胞來源的外泌體的臨床應(yīng)用將在以下部分詳細(xì)討論。

外泌體存在于所有體液中，例如血液、唾液、尿液、血漿、眼淚、精液、羊水，甚至母乳。體液來源的外泌體是疾病生物標(biāo)志物的高度穩(wěn)定的儲存庫，有助于在癌癥、心血管疾病和圍產(chǎn)期疾病等各種臨床環(huán)境中進(jìn)行液體活檢。然而，每種類型體液的共存內(nèi)容和可用性可能會給外泌體分離帶來挑戰(zhàn)。

外泌體的生產(chǎn)、分離和純化

阻礙基于外泌體的療法進(jìn)入臨床實(shí)踐的主要障礙之一是外泌體的產(chǎn)量和效率較低。例如，在實(shí)驗(yàn)室環(huán)境中，從1ml培養(yǎng)基中只能收獲不到1μg的外泌體蛋白。擴(kuò)大外泌體產(chǎn)量的方法有多種，分為生化策略（例如 LPS、BMP-2、HIF-1α、IFN-γ和TNF-α）、物理策略（缺氧、熱應(yīng)激和饑餓） 、機(jī)械策略（剪切應(yīng)力和 3D 培養(yǎng)）和儀器策略（中空纖維生物反應(yīng)器和攪拌槽生物反應(yīng)器）。

外泌體在大小、含量、表面標(biāo)記和來源方面具有異質(zhì)性，這使得它們的分離變得困難。目前可用的外泌體分離和純化技術(shù)基于其大小、表面電荷或免疫親和力（圖1a）。然而，不存在“一刀切”的方法，因?yàn)檫@些技術(shù)都有優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)。

例如，超速離心被認(rèn)為是外泌體提取的金標(biāo)準(zhǔn)。盡管它需要最少的試劑和專業(yè)知識，但耗時(shí)、成本高、效率低以及脂蛋白共分離限制了其大規(guī)模使用。免疫親和層析是一種基于抗體和配體特異性結(jié)合的分離技術(shù)。它快速且具有高純度、特異性和產(chǎn)量。然而，所使用的抗原/蛋白質(zhì)偶聯(lián)需要在外泌體表面表達(dá)。

基于尺寸的分離技術(shù)主要指超濾和尺寸排阻色譜，這兩種技術(shù)都快速且適合大規(guī)模應(yīng)用。但毛孔堵塞、外泌體丟失、純度低等問題使得該方法難以普及。雖然沒有一種技術(shù)是完美的，但將上述技術(shù)與其他技術(shù)（例如基于沉淀和基于微流體的技術(shù)）相結(jié)合可能是同時(shí)滿足外泌體分離和純化多種要求的解決方案。

外泌體的修飾

可以對外泌體進(jìn)行生化修飾，以擴(kuò)大、改變或改善其治療效果。外泌體的修飾分為內(nèi)部策略（例如載藥）和外部策略（例如表面修飾）。一方面，外泌體由于其穩(wěn)定性、非免疫原性和靶向受體細(xì)胞等優(yōu)勢，可能成為遞送藥物、核酸和疫苗的理想治療載體。有多種貨物裝載技術(shù)，包括生產(chǎn)前裝載方法（例如轉(zhuǎn)染、共孵育和電穿孔）和生產(chǎn)后裝載方法（例如凍融循環(huán)、孵育、超聲處理、擠壓和低滲透析），具體取決于關(guān)于它們是否在外泌體生物發(fā)生之前或之后應(yīng)用（圖1c）。

另一方面，外泌體表面修飾的例子有外泌體膜或親本細(xì)胞的基因工程、靶向配體的化學(xué)連接、靜電相互作用和磁性納米顆粒技術(shù)。表面修飾的主要目的是選擇性地將外泌體遞送至靶細(xì)胞以進(jìn)行精準(zhǔn)治療。

外泌體的表征和驗(yàn)證

外泌體在治療應(yīng)用之前需要進(jìn)行表征和驗(yàn)證。目前用于外泌體表征的方法主要集中于外泌體的大小、形態(tài)和貨物概況。面向尺寸的驗(yàn)證包括納米顆粒跟蹤分析 (NTA)、動態(tài)光散射 (DLS) 和可調(diào)電阻脈沖傳感 (TRPS)，而面向形態(tài)的分析包括掃描電子顯微鏡 (SEM) 和透射電子顯微鏡 (TEM)。此外，貨物分析進(jìn)一步細(xì)分為蛋白質(zhì)組學(xué)、脂質(zhì)組學(xué)和基因組分析，包括蛋白質(zhì)印跡、ELISA、流式細(xì)胞術(shù)、質(zhì)譜和PCR。由于上述每種表征方法都有優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)，因此結(jié)合三個(gè)不同方面的分析（例如TEM、NTA和蛋白質(zhì)印跡法）來鑒定分離的外泌體是一種普遍的做法。

例如，基于顯微鏡的方法，如SEM和TEM，可以分別直接可視化表面形貌和內(nèi)部結(jié)構(gòu)。但TEM由于操作復(fù)雜、樣品制備繁瑣，不適合大量樣品的快速測量。NTA有助于快速檢測和實(shí)時(shí)外泌體觀察，同時(shí)具有比流式細(xì)胞術(shù)更高的分辨率。NTA的主要缺點(diǎn)是難以區(qū)分外泌體和污染的蛋白質(zhì)。作為一項(xiàng)成熟的技術(shù)，蛋白質(zhì)印跡可以定性和定量檢測外泌體蛋白生物標(biāo)志物的表達(dá)，特別是來自細(xì)胞培養(yǎng)基的外泌體。然而，該方法耗時(shí)且不適合檢測生物體液中的外泌體。

外泌體的儲存

目前用于長期保存外泌體的保存方法主要包括冷凍保存、凍干和噴霧干燥。溫度和防凍劑是低溫保存的兩個(gè)最重要的因素。4℃儲存可能會削弱外泌體的生物活性并減少外泌體的蛋白質(zhì)含量，而-80℃被認(rèn)為是最佳溫度，對外泌體形態(tài)和含量的影響最小。非滲透性二糖防凍劑，尤其是海藻糖，是最佳選擇，因?yàn)樗梢苑乐雇饷隗w聚集和冷凍損傷。

經(jīng)過冷凍干燥處理的熱敏材料，例如外泌體和疫苗，只需加水即可輕松儲存和重構(gòu)。最近的一項(xiàng)研究表明，即使在室溫下保存，使用冷凍保護(hù)劑凍干也可以將外泌體蛋白和RNA的活性保留大約4周。

最后，與冷凍干燥相比，噴霧干燥是一個(gè)單步驟過程，從而減少了對昂貴設(shè)備和冗長的多步驟研磨的需求。然而，噴霧干燥的核心參數(shù)，如外泌體進(jìn)料速率、霧化壓力和出口溫度，都會影響外泌體穩(wěn)定性和貨物完整性。

干細(xì)胞外泌體的臨床應(yīng)用

• 干細(xì)胞外泌體療法與骨科和創(chuàng)傷手術(shù)
• 干細(xì)胞外泌體療法與神經(jīng)外科
• 干細(xì)胞外泌體療法與整形外科
• 干細(xì)胞外泌體療法與普通外科
• 干細(xì)胞外泌體療法與心胸外科
• 干細(xì)胞外泌體療法與泌尿外科和
• 干細(xì)胞外泌體療法與耳鼻喉科和頭頸外科
• 干細(xì)胞外泌體療法與眼科
• 干細(xì)胞外泌體療法與婦產(chǎn)科

外泌體療法從臨床前研究到臨床試驗(yàn)

正如第3節(jié)至第11節(jié)所討論的，許多臨床前研究已經(jīng)證實(shí)了MSC衍生的和NSC衍生的外泌體在治療跨越外科實(shí)踐亞專業(yè)的許多疾病方面的優(yōu)勢。不僅限于干細(xì)胞來源的外泌體，許多臨床試驗(yàn)已經(jīng)證明外泌體具有雙重作用：生物標(biāo)記物和治療劑。在ClinicalTrials.gov上使用“外泌體治療”、“外泌體治療”和“外泌體”作為關(guān)鍵詞進(jìn)行搜索，生成了188條記錄。然而，其中只有60項(xiàng)（32%）與使用外泌體作為治療劑的介入研究直接相關(guān)（表5）。

其余的，特別是腫瘤學(xué)相關(guān)的試驗(yàn)，大多使用外泌體作為生物標(biāo)志物，例如疾病發(fā)病過程中的關(guān)鍵角色（例如NCT04288141，NCT04154332），診斷標(biāo)志物和治療前的指導(dǎo)（例如NCT04629079，NCT03791073，NCT05451342，NCT03432806），監(jiān)測指標(biāo)治療效率的預(yù)測工具（例如，NCT05427227、NCT04499794、NCT04852653、NCT05370105、NCT03800121、NCT05370105、NCT05328089）和治療后的預(yù)后指標(biāo)（例如，NCT06026735、NCT05705583、NCT05） 411445、NCT04167722、NCT05575622）。外泌體作為生物標(biāo)志物的臨床應(yīng)用已在其他綜述中進(jìn)行了廣泛探討,因此在本綜述中不予討論^。就60項(xiàng)外泌體治療臨床試驗(yàn)的臨床特征而言（表5），有幾個(gè)亮點(diǎn)值得一提。

首先，所涵蓋的疾病范圍非常廣泛，包括外科疾病和內(nèi)科疾病。其中包括第3至11節(jié)中討論的許多外科疾病，例如骨科疾病（NCT05060107中的膝骨關(guān)節(jié)炎、NCT04998058中的骨質(zhì)流失和NCT04849429中的椎間盤退變）、神經(jīng)外科疾病（NCT03384433中的缺血性中風(fēng)和NCT04388982中的阿爾茨海默病） 、整形外科疾病（NCT02565264和NCT05475418中的皮膚傷口愈合）、普通外科疾病（NCT05871463中的肝硬化）、心胸疾病（NCT05669144中的心肌梗塞）、眼科疾病（NCT05413148中的視網(wǎng)膜色素變性）。

也就是說，一些臨床前研究還沒有發(fā)展到臨床試驗(yàn)。這些包括但不限于用于骨折、脊髓損傷、創(chuàng)傷性腦損傷、急性肝損傷、和聽力損失的外泌體療法，這可能作為外泌體療法相關(guān)臨床試驗(yàn)的未來方向。

其次，越來越多的臨床試驗(yàn)集中在兩種疾病上，即COVID-19（16項(xiàng)試驗(yàn)，占27%）和癌癥（5項(xiàng)試驗(yàn)，8%）。MSC 衍生的外泌體可以通過修復(fù)作用和再生作用來控制COVID-19中的病毒感染和肺損傷。前者表現(xiàn)為阻斷病毒進(jìn)入和復(fù)制以及抑制細(xì)胞因子風(fēng)暴，而后者則表現(xiàn)為預(yù)防炎癥、清除液體和恢復(fù)肺通透性。此外，外泌體可以被設(shè)計(jì)成藥物（例如，CD24，一種有效的免疫調(diào)節(jié)劑）遞送平臺，甚至疫苗來對抗COVID-19。與用于COVID-19管理的MSC衍生的外泌體相比，用于癌癥治療的外泌體主要依賴于非干細(xì)胞和貨物工程。這部分是因?yàn)殚g充質(zhì)干細(xì)胞衍生的外泌體對腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移的影響存在爭議。雖然MSC衍生的外泌體與腫瘤細(xì)胞之間的確切相互作用仍有爭議，但科學(xué)家們通過修飾外泌體貨物以遞送抗癌核酸和抗癌藥物，以及用于特定腫瘤靶向的外泌體膜，克服了一些障礙。

最后，在使用干細(xì)胞來源的外泌體進(jìn)行疾病治療的40項(xiàng)臨床試驗(yàn)中，38項(xiàng)（95%）使用MSC，2項(xiàng)（5%）使用iPSC作為外泌體的細(xì)胞來源。然而，這與第3節(jié)至第11節(jié)中討論的臨床前研究存在顯著差異。在臨床試驗(yàn)中缺乏使用 NSC 衍生的外泌體可能部分是因?yàn)槠溆H代細(xì)胞的供應(yīng)限制。

目前，神經(jīng)干細(xì)胞可以從三個(gè)來源獲得（圖1a）：

• 1、從原代CNS組織（例如成人和胎兒大腦）中分離；
• 2、從多能干細(xì)胞（例如iPSC和ESC）分化；
• 3、將體細(xì)胞（例如成纖維細(xì)胞和血細(xì)胞）重編程為iNSC。最近的研究開發(fā)了成纖維細(xì)胞衍生的iNSC，為從NSC樣細(xì)胞獲取外泌體打開了新窗口。

這些iNSC-exo不僅可以在體外促進(jìn)細(xì)胞存活和增殖，其效果不亞于NSC-exo，而且還可以增強(qiáng)缺血性中風(fēng)后的恢復(fù)并減輕臨床前模型中的AD樣表型。因此，iNSC可能是在臨床試驗(yàn)中生產(chǎn)臨床級外泌體的極好細(xì)胞來源。

總之，外泌體療法從臨床前研究到臨床試驗(yàn)的進(jìn)展非常迅速。然而，外泌體治療的臨床適應(yīng)證不足和親本干細(xì)胞來源有限等問題仍有待解決。此外，一旦克服了生產(chǎn)規(guī)模擴(kuò)大、遵守良好生產(chǎn)規(guī)范和監(jiān)管框架方面的限制（表1）， 干細(xì)胞衍生的外泌體療法將很快納入臨床實(shí)踐并在患者床邊服務(wù)。

結(jié)論和未來展望

最近，外泌體被視為干細(xì)胞療法的無細(xì)胞替代品。ESC、iPSC、HSC、MSC、NSC 和 EPC 衍生的外泌體特別令人感興趣，部分原因是其親本細(xì)胞的多能性。經(jīng)過修飾或不修飾的生產(chǎn)和純化后，干細(xì)胞來源的外泌體在治療外科手術(shù)中遇到的多種疾病方面表現(xiàn)出了巨大的潛力。

例如骨科手術(shù)中的疾病（例如骨折、骨關(guān)節(jié)炎和脊髓損傷）；神經(jīng)外科（例如，缺血性中風(fēng)、創(chuàng)傷性腦損傷和阿爾茨海默病）；整形手術(shù)（例如傷口愈合）；普通外科手術(shù)（例如急性肝損傷）；心胸外科手術(shù)（例如心肌梗塞）；泌尿科（例如慢性腎病）；頭頸手術(shù)（例如感音神經(jīng)性聽力損失）；眼科（例如，獲得性視神經(jīng)病變）和婦科（例如，原發(fā)性卵巢功能不全）。

從機(jī)制上講，干細(xì)胞來源的外泌體的多種治療作用是通過疾病特異性細(xì)胞和組織反應(yīng)（例如組織再生、抗炎、抗細(xì)胞死亡、免疫調(diào)節(jié)和抗氧化應(yīng)激）和組織特異性分子來實(shí)現(xiàn)的。信號通路（例如 Wnt/β-連環(huán)蛋白、PTEN/PI3K/Akt/HIF-1α、MAPK 和 JAK/STAT 通路）。總的來說，干細(xì)胞衍生的外泌體療法已被證明是外科領(lǐng)域干細(xì)胞療法的有效且多功能的替代品。

參考資料：Tan, F., Li, X., Wang, Z. et al. Clinical applications of stem cell-derived exosomes. Sig Transduct Target Ther 9, 17 (2024). https://doi.org/10.1038/s41392-023-01704-0

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