間充質(zhì)干細(xì)胞/基質(zhì)細(xì)胞 (MSC) 因其多能性、免疫調(diào)節(jié)特性和促進(jìn)組織修復(fù)的能力，已成為再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域極具前景的治療藥物。近期研究表明，MSC 的治療作用主要由其旁分泌釋放細(xì)胞外囊泡 (EV) 介導(dǎo)，其中包括外泌體，這是一種促進(jìn)細(xì)胞間通訊的膜結(jié)合小顆粒。MSC衍生的EV (MSC-EV) 富含蛋白質(zhì)、RNA和脂質(zhì)，可以調(diào)節(jié)受損組織的微環(huán)境，增強(qiáng)細(xì)胞遷移、增殖和分化等再生過(guò)程。本章重點(diǎn)介紹MSC-EV及其治療潛力。

解碼間充質(zhì)干細(xì)胞外囊泡：從生物發(fā)生機(jī)制到臨床轉(zhuǎn)化全景

文中涵蓋了各種EV分離方法，并探討了EV的儲(chǔ)存、表征和臨床應(yīng)用，表明它們提供了一種比傳統(tǒng)細(xì)胞療法更安全、更具可擴(kuò)展性的替代方案。然而，將MSC-EV的生產(chǎn)、分離和表征標(biāo)準(zhǔn)化以供臨床使用仍然具有挑戰(zhàn)性。未來(lái)的研究應(yīng)側(cè)重于優(yōu)化流程、了解MSC-EVs藥代動(dòng)力學(xué)以及針對(duì)最大治療潛力的機(jī)制^[1]。

1、簡(jiǎn)介

間充質(zhì)干細(xì)胞治療潛力與機(jī)制認(rèn)知演變

間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）因其多向分化潛能（可分化為成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和軟骨細(xì)胞）及自我更新能力，成為再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的明星療法。傳統(tǒng)理論認(rèn)為，移植的MSCs能歸巢至損傷部位，通過(guò)直接分化為目標(biāo)細(xì)胞（如軟骨細(xì)胞）修復(fù)組織。但最新研究表明，MSCs主要通過(guò)旁分泌途徑釋放生長(zhǎng)因子、趨化因子和細(xì)胞因子發(fā)揮治療作用，而非直接分化。盡管其修復(fù)機(jī)制尚未完全闡明，MSCs仍被廣泛用于免疫調(diào)節(jié)和組織再生臨床試驗(yàn)。

間充質(zhì)干細(xì)胞在臨床應(yīng)用面臨的多重挑戰(zhàn)

MSC療法存在顯著局限性：供體差異（健康狀態(tài)、遺傳背景、年齡性別）導(dǎo)致細(xì)胞異質(zhì)性；組織來(lái)源（骨髓、脂肪、臍帶等）影響干性及分化能力；培養(yǎng)條件（融合度、氧氣濃度、傳代次數(shù)）改變擴(kuò)增效率；免疫相容性受宿主微環(huán)境（如炎癥狀態(tài)）調(diào)控，可能觸發(fā)MHC-II類分子表達(dá)。此外，給藥方式、移植位點(diǎn)及載體材料也制約細(xì)胞歸巢效能。

外泌體療法的突破性進(jìn)展

新證據(jù)揭示MSCs通過(guò)分泌營(yíng)養(yǎng)因子協(xié)調(diào)再生過(guò)程（細(xì)胞遷移、增殖、基質(zhì)合成等）。2010年研究發(fā)現(xiàn)，MSCs衍生的外泌體（MSC-Exos）可緩解心肌缺血再灌注損傷，此后其在軟骨修復(fù)中展現(xiàn)潛力。目前臨床試驗(yàn)主要采用脂肪、骨髓或臍帶來(lái)源的MSC-Exos，其中脂肪組織為臨床研究首選來(lái)源，且因外泌體低免疫原性，異體移植成為主流方案。但MSC-Exos尚無(wú)標(biāo)準(zhǔn)化制備流程。

細(xì)胞外囊泡的研究進(jìn)展

細(xì)胞外囊泡（EVs）是脂質(zhì)雙分子層包裹的納米顆粒，攜帶跨膜蛋白、RNA及代謝物，介導(dǎo)細(xì)胞間通訊。自1946年首次在血液中被發(fā)現(xiàn)，EVs歷經(jīng)數(shù)十年研究：1960年代稱”血小板塵埃”；1980年代在直腸腺瘤細(xì)胞中被觀測(cè)；1987年”外泌體”術(shù)語(yǔ)正式確立。77年來(lái)，學(xué)界確認(rèn)幾乎所有細(xì)胞均分泌EVs，其廣泛存在于生物體液中，成為疾病診療的新靶點(diǎn)（表1）。

2、細(xì)胞外囊泡的分類

EVs的核心功能與生物意義

細(xì)胞外囊泡（EVs）是細(xì)胞間通訊的關(guān)鍵信使，負(fù)責(zé)傳遞包括蛋白質(zhì)、核酸、代謝物甚至完整細(xì)胞器在內(nèi)的多種“貨物”。它們?cè)诙喾N生物體的生理和病理?xiàng)l件下促進(jìn)細(xì)胞間通訊的作用已被廣泛研究。所有細(xì)胞類型（包括干細(xì)胞）均可分泌EVs，并存在于唾液、淚液、血漿、血清、腦脊液、支氣管液、滑膜液、羊水、母乳、尿液、精液、淋巴液、膽汁和胃酸等體液中。

值得注意的是，EVs的分泌和成分可適應(yīng)不同生物環(huán)境，因此成為多種疾病的重要生物標(biāo)志物。此外，科學(xué)家已將EVs開發(fā)為藥物遞送載體，并將其作為獨(dú)立治療劑使用。

分類體系的演變與爭(zhēng)議

EVs是由各類細(xì)胞釋放到胞外空間的膜性納米顆粒，在細(xì)胞間通訊中發(fā)揮關(guān)鍵作用。它們攜帶獨(dú)特的“貨物”（包括核酸、蛋白質(zhì)和信號(hào)分子），反映源細(xì)胞的狀態(tài)。國(guó)際細(xì)胞外囊泡學(xué)會(huì)（ISEV）2018年指南提出了分類系統(tǒng)，但傳統(tǒng)的三分類法仍普遍使用：根據(jù)尺寸、生物形成機(jī)制和表面標(biāo)志物，EVs可分為外泌體、微囊泡（MVs）和凋亡小體（表2）。

• 外泌體（直徑30–150nm）：通過(guò)多囊泡體（MVBs）與質(zhì)膜融合形成；
• 微囊泡（直徑50–1000 nm）：由質(zhì)膜向外出芽并脫落產(chǎn)生；
• 凋亡小體（直徑50–5000 nm）：細(xì)胞凋亡過(guò)程中產(chǎn)生。

由于三分類法中存在表面標(biāo)志物不明確和尺寸重疊的問(wèn)題，ISEV建議采用修訂方案：按物理特性（如<200 nm為小型EVs，>200 nm為大型EVs）、密度（低/中/高）、表面標(biāo)志物（如CD63+或膜聯(lián)蛋白V染色的EVs）、細(xì)胞來(lái)源（如MSC衍生的EVs）或細(xì)胞狀態(tài)（如缺氧EVs）分類。

新型非囊泡顆粒的突破性發(fā)現(xiàn)

隨著分離技術(shù)進(jìn)步，EV領(lǐng)域擴(kuò)展到非囊泡細(xì)胞外顆粒（NVEPs）——這類無(wú)脂質(zhì)雙層的顆粒包括脂蛋白、穹窿體，以及新發(fā)現(xiàn)的外泌聚合體（exomeres，~35nm）和超級(jí)聚合體（supermeres）。外泌聚合體含糖酵解酶等特定蛋白，可通過(guò)不對(duì)稱流場(chǎng)流分離技術(shù)（AF4）獲取；超級(jí)聚合體則在外泌聚合體上清液中發(fā)現(xiàn)，具有獨(dú)特蛋白/RNA組成，能穿越血腦屏障，在結(jié)直腸癌細(xì)胞中攜帶大量胞外RNA，并可介導(dǎo)代謝重編程與耐藥性傳遞，為疾病機(jī)制研究開辟新方向。

3、EV的生物合成和吸收

EVs的攝取機(jī)制

靶細(xì)胞通過(guò)受體介導(dǎo)內(nèi)吞、網(wǎng)格蛋白包被小窩、脂筏、吞噬作用、小窩蛋白介導(dǎo)內(nèi)吞及巨胞飲等多種途徑攝取完整EVs。囊泡進(jìn)入靶細(xì)胞后可逃逸內(nèi)體/溶酶體以釋放內(nèi)容物。EVs與靶細(xì)胞膜相互作用可誘導(dǎo)兩種結(jié)果：一是通過(guò)配體-受體相互作用觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)，二是外泌體直接與細(xì)胞膜融合，將內(nèi)容物釋放至胞質(zhì)。值得注意的是，EVs的靶細(xì)胞涵蓋癌細(xì)胞、損傷實(shí)質(zhì)細(xì)胞及免疫細(xì)胞，凸顯其在細(xì)胞通訊與生理過(guò)程中的廣泛影響[23,33]。

外泌體的生物發(fā)生核心

外泌體在內(nèi)體系統(tǒng)中形成：晚期內(nèi)體膜向內(nèi)出芽，在多泡內(nèi)體（MVEs）內(nèi)形成腔內(nèi)囊泡（ILVs）。此過(guò)程重定位跨膜蛋白（胞外域朝外、胞質(zhì)尾朝內(nèi)）并封裝貨物。MVEs與細(xì)胞膜融合后，釋放30–150 nm的外泌體[27,33,35]。ESCRT復(fù)合物（運(yùn)輸所需內(nèi)體分選復(fù)合體）在ILVs分選及外泌體形成中起關(guān)鍵作用，同時(shí)參與細(xì)胞膜向外出芽釋放囊泡和病毒的過(guò)程[36]。

關(guān)鍵調(diào)控蛋白的作用

Syntenin 1與四跨膜蛋白（TSPANs，如CD9/CD63/CD81）共同調(diào)控外泌體形成與貨物裝載[27,37-39]。Syntenin 1雖主要富集于小型EVs，但也存在于大型EVs中；TSPANs雖是經(jīng)典外泌體標(biāo)志物，但最新研究發(fā)現(xiàn)含TSPAN的小型EVs可直接源自細(xì)胞膜（稱為胞外體或微囊泡）。其中CD63通過(guò)介導(dǎo)質(zhì)膜與細(xì)胞器間的循環(huán)通路定向引導(dǎo)EV貨物分選。

RAB蛋白的精密調(diào)控

小G蛋白R(shí)AB家族（如RAB7/11/35/27A/27B）協(xié)調(diào)囊泡運(yùn)輸與外泌體釋放：

• RAB7調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）-內(nèi)體接觸位點(diǎn)，促進(jìn)外泌體生成；
• RAB27A介導(dǎo)ARL8B向RAB27A的轉(zhuǎn)化，驅(qū)動(dòng)ILVs向細(xì)胞膜運(yùn)輸；
• RAB13負(fù)責(zé)釋放含β1-整合素的小EVs（區(qū)別于CD63+外泌體）；
• RAB31參與ESCRT非依賴的外泌體形成通路。抑制這些RAB蛋白將阻斷外泌體分泌。

生物發(fā)生的雙路徑機(jī)制

ESCRT依賴途徑	ESCRT非依賴途徑
晚期內(nèi)體膜向內(nèi)出芽形成ILVs	神經(jīng)酰胺-鞘磷脂轉(zhuǎn)換介導(dǎo)ILVs生成
MVB成熟后與質(zhì)膜融合釋放外泌體	微囊泡（MVs）通過(guò)質(zhì)膜向外出芽形成
主導(dǎo)跨膜蛋白分選	涉及細(xì)胞骨架降解等機(jī)制

EVs釋放后的三大歸宿

• 鄰近細(xì)胞捕獲：影響局部細(xì)胞通訊與微環(huán)境；
• 親代細(xì)胞重吸收：形成復(fù)雜反饋調(diào)節(jié)環(huán)路；
• 進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)：被遠(yuǎn)端器官細(xì)胞攝取，實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)程跨組織通訊。
  此過(guò)程凸顯EVs作為系統(tǒng)性信號(hào)載體的核心功能。

4、EV的生物學(xué)功能

EVs的生理與病理全景作用

近期有力證據(jù)表明，胞外囊泡在正常生理過(guò)程和疾病等各個(gè)領(lǐng)域發(fā)揮著重要作用。正常生理過(guò)程包括發(fā)育、組織穩(wěn)態(tài)、衰老、代謝調(diào)節(jié)、運(yùn)動(dòng)、應(yīng)激反應(yīng)、晝夜節(jié)律、妊娠期分子轉(zhuǎn)移、母乳喂養(yǎng)、進(jìn)食和寄生蟲相互作用。疾病可分為非感染性疾病和感染性疾病，包括癌癥、炎癥、代謝紊亂、自身免疫、神經(jīng)退行性疾病、慢性肺阻塞性疾病和成癮，以及由病毒、原生動(dòng)物、真菌、蠕蟲、節(jié)肢動(dòng)物和其他病原體引起的各種傳染病。

核心生物學(xué)機(jī)制解析

EV在細(xì)胞自主和互動(dòng)功能中都發(fā)揮著關(guān)鍵作用，包括供體細(xì)胞中的蛋白質(zhì)質(zhì)量控??制、介導(dǎo)信號(hào)傳導(dǎo)、分子轉(zhuǎn)移和 ECM 重塑。蛋白質(zhì)質(zhì)量控??制的關(guān)鍵機(jī)制是外泌體生物合成，它能夠快速、選擇性地從質(zhì)膜上消除蛋白質(zhì)。

其中，EVs的核心功能包括：

蛋白質(zhì)質(zhì)控：通過(guò)外泌體生物發(fā)生清除質(zhì)膜異常蛋白；

廢物清除：分泌未屏蔽RNA、化學(xué)修飾RNA及淀粉樣蛋白（amyloidogenic proteins）；

多信號(hào)傳遞：作為”復(fù)合信號(hào)粒子”轉(zhuǎn)移功能性受體/效應(yīng)器；

ECM調(diào)控：參與骨形成、血栓啟動(dòng)及神經(jīng)退行病變中淀粉樣聚集體擴(kuò)散。

5、間充質(zhì)干細(xì)胞療法的瓶頸與認(rèn)知革新

MSC 具有一系列有益特性，包括免疫調(diào)節(jié)、促血管生成、促神經(jīng)生成、抗凋亡和抗炎能力，這些特性歸因于其固有的歸巢至損傷部位的能力。

最初，人們認(rèn)為MSC通過(guò)歸巢至受損組織并植入，然后分化取代受損細(xì)胞來(lái)介導(dǎo)愈合。然而，后續(xù)研究表明，MSC 的旁分泌作用才是其治療益處的主要原因。然而，MSC的典型細(xì)胞活動(dòng)（包括自我復(fù)制和分化）會(huì)帶來(lái)風(fēng)險(xiǎn)，包括致癌轉(zhuǎn)化和免疫介導(dǎo)的排斥反應(yīng)。因此，由于相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)，MSC在人體中的臨床應(yīng)用僅限于特定的細(xì)胞類型和疾病。相比之下，MSC-EVs復(fù)制了若干母細(xì)胞特性，有時(shí)甚至超越它們，尤其是在免疫和炎癥環(huán)境中。

與其祖細(xì)胞不同，MSC-EVs不具有復(fù)制和分化特性。它們?cè)诩?xì)胞外環(huán)境中具有更高的安全性、高效的運(yùn)輸和有效的組織穿透性，這些優(yōu)勢(shì)非常顯著，尤其是在體內(nèi)給藥方面。MSC-EVs獨(dú)特的運(yùn)作機(jī)制表明，它們?nèi)狈ζ溆H本細(xì)胞的多種結(jié)構(gòu)和功能特性，從而增強(qiáng)了其安全性和治療潛力（表3）。

MSC-EVs的突破性治療優(yōu)勢(shì)

相較于MSCs，MSC來(lái)源EVs（MSC-EVs） 具備革命性優(yōu)勢(shì)：

• 安全性：無(wú)自我復(fù)制/分化能力，規(guī)避癌變風(fēng)險(xiǎn)；
• 免疫兼容性：無(wú)細(xì)胞療法免疫原性，避免排斥反應(yīng)；
• 微環(huán)境穩(wěn)定性：不受病變組織微環(huán)境影響（如胰腺癌中MSCs會(huì)促癌）；
• 遞送效率：直徑僅100-300nm，可穿透血腦屏障，避免肺毛細(xì)血管滯留（MSCs直徑15-30μm會(huì)致肺部栓塞）。

EVs的臨床轉(zhuǎn)化核心價(jià)值

特性	MSCs	MSC-EVs
直徑	15-30 μm	100-300 nm
體內(nèi)滯留	肺/肝/脾聚集	全身長(zhǎng)效循環(huán)
免疫風(fēng)險(xiǎn)	引發(fā)排斥反應(yīng)[54]	幾乎無(wú)免疫原性
工程化潛力	困難	易基因改造裝載藥物
靶向修飾	不可行	表面蛋白可定向修飾

臨床應(yīng)用前景與挑戰(zhàn)

臨床前研究表明MSC-EVs副作用顯著低于細(xì)胞療法，但需解決：

標(biāo)準(zhǔn)化定量：尚無(wú)統(tǒng)一EVs給藥計(jì)量標(biāo)準(zhǔn)；

藥效評(píng)估：需完善藥代/藥效動(dòng)力學(xué)研究；

工程化優(yōu)化：改造后EVs雖潛力更大，但需建立標(biāo)準(zhǔn)化制備流程。EVs療法有望成為下一代無(wú)細(xì)胞治療平臺(tái)。

6、MSC-EVs的組成

異質(zhì)性來(lái)源與尺寸多樣性

MSC-EVs的組成異質(zhì)性源于其尺寸差異（30-2000 nm）及細(xì)胞來(lái)源特異性：

• 生產(chǎn)機(jī)制：多泡體（MVB）膜的不均勻內(nèi)陷導(dǎo)致囊泡內(nèi)容物（蛋白質(zhì)/核酸/液體）分布不均；
• 分離方法：不同分離技術(shù)（如超速離心、尺寸排阻色譜）可能混雜其他EV亞型，造成尺寸混雜；
• 亞群存在：先進(jìn)分餾技術(shù)證實(shí)，小EVs（含外泌體）內(nèi)部存在按尺寸定義的亞群（如30-50nm vs. 80-150nm）。

關(guān)鍵影響：尺寸差異直接影響貨物載量及靶細(xì)胞相互作用效率。

分子組成：膜蛋白與胞質(zhì)貨物

膜相關(guān)組分

類別	代表性分子	功能
跨膜蛋白	CD9, CD63, CD81 (TSPAN家族), MHC II復(fù)合物	細(xì)胞黏附、免疫識(shí)別
ESCRT復(fù)合物	TSG101, Alix	囊泡出芽與貨物分選
信號(hào)分子	整合素家族, RAB GTP酶 (RAB4/11/27)	細(xì)胞通訊與囊泡運(yùn)輸調(diào)控
脂筏標(biāo)志物	膽固醇, 鞘磷脂, GPI錨定蛋白, Flotillin	維持膜結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性

胞質(zhì)貨物

• 結(jié)構(gòu)蛋白：肌動(dòng)蛋白（Actin）、微管蛋白（Tubulin）、絲切蛋白（Cofilin）；
• 分子伴侶：熱休克蛋白Hsp70/Hsp90；
• 核酸結(jié)合蛋白：RNA結(jié)合蛋白（RBPs）、核糖核蛋白復(fù)合物。

核酸成分：爭(zhēng)議與特征

DNA：存在性爭(zhēng)議

• 否定觀點(diǎn)：基于蛋白質(zhì)組學(xué)分析，外泌體不含雙鏈DNA及組蛋白，細(xì)胞外DNA分泌依賴自噬-MVE通路；
• 肯定證據(jù)：成像流式細(xì)胞術(shù)證實(shí)外泌體攜帶雙鏈DNA，核內(nèi)容物可通過(guò)未知機(jī)制裝載。

RNA：組成與功能瓶頸

RNA類型	平均長(zhǎng)度	富集特征	功能限制
miRNA	18-24 nt	MSC-EVs中濃度比母細(xì)胞高10倍	單囊泡僅含1.3個(gè)pre-miRNA分子
mRNA	100-400 nt	片段化嚴(yán)重	無(wú)法翻譯全長(zhǎng)功能蛋白[66,80-83]
非編碼RNA	circRNA, tRNA	選擇性富集	調(diào)控受體細(xì)胞基因表達(dá)

miRNA裝載機(jī)制：

• nSMase2依賴途徑
• SUMO化hnRNPs依賴途徑
• miRNA 3′序列依賴性途徑
• miRISC相關(guān)途徑

脂質(zhì)雙層結(jié)構(gòu)與動(dòng)態(tài)性

• 厚度：5nm ；
• 核心脂質(zhì)：膽固醇、鞘磷脂、神經(jīng)酰胺、磷脂酰絲氨酸（保守性強(qiáng)，跨細(xì)胞類型差異小）；
• 功能關(guān)聯(lián)：脂筏結(jié)構(gòu)（含膽固醇/GPI錨定蛋白）介導(dǎo)靶向運(yùn)輸。

組成影響因素與純度挑戰(zhàn)

動(dòng)態(tài)變量

1. 微環(huán)境調(diào)控：缺氧/炎癥狀態(tài)改變EVs的蛋白質(zhì)組（如ECM蛋白、代謝酶）；
2. 分離方法：蛋白酶污染可能導(dǎo)致跨膜蛋白（CD44/CD73/CD90）酶切，形成游離片段污染；
3. 標(biāo)志物異質(zhì)性：同一批EVs中特定貨物（如miRNA）豐度差異顯著，需謹(jǐn)慎選擇純化標(biāo)志物。

純度評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)

• 正向標(biāo)志物：跨膜蛋白（CD9/CD63/CD81）、MSC表面抗原（CD44/CD73/CD90）；
• 負(fù)向標(biāo)志物：脂蛋白、載脂蛋白（APOA1/2, APOB）、白蛋白（提示肝細(xì)胞污染）；
• 建議策略：量化污染物清除效率，而非依賴二元檢測(cè)。

細(xì)胞內(nèi)源污染物

部分EVs可能攜帶非典型組分（如線粒體、高爾基體片段），但小EVs（<200 nm）中極少富集。

總結(jié)：MSC-EVs的組成是其功能多樣性的物質(zhì)基礎(chǔ)，但異質(zhì)性、動(dòng)態(tài)變化及純度問(wèn)題仍是臨床轉(zhuǎn)化的核心挑戰(zhàn)。未來(lái)需結(jié)合單囊泡分析技術(shù)深化機(jī)制研究。

7、MSC-EVs的6種分離方法

EVs的分離方法對(duì)后續(xù)研究與生產(chǎn)至關(guān)重要。目前主要采用以下六種技術(shù)：

1. 超速離心法（UC）
2. 密度梯度離心法（DGC）
3. 超濾法
4. 尺寸排阻色譜法（SEC）
5. 聚合物沉淀法
6. 免疫親和純化法

下文將概述這些現(xiàn)代分離技術(shù)的原理與應(yīng)用。

根據(jù)密度差異，EV可與乳糜微粒、VLDL、IDL 和 LDL 區(qū)分開來(lái)（表4）；這些顆粒的密度低于EV（<1.063 g/mL）。相反，高密度脂蛋白的密度與 EV 相似（1.06~1.21 g/mL），只能通過(guò)尺寸差異與EV分離（參見表2）。分離EV的方法多種多樣（表5），每種方法都有其獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)。

粒子類型	尺寸（納米）	密度（克/毫升）
乳糜微粒	75–1200	<0.95
乳糜微粒殘留物	30–80	0.95–1.006
極低密度脂蛋白（VLDL）	30–80	0.95–1.006
中密度脂蛋白（IDL）	23–27	1.006–1.019
低密度脂蛋白（LDL）	18–23	1.019–1.063
高密度脂蛋白（HDL）	7–13	1.063–1.21
細(xì)胞外囊泡	30–1000	1.06–1.21

方法	原理	優(yōu)勢(shì)	局限性
超速離心法 (UC)	利用高速離心力沉降EVs	可高效沉淀EVs	對(duì)小尺寸/低密度顆粒效率低；重復(fù)離心降低得率（囊泡損失與結(jié)構(gòu)損傷）
密度梯度離心法 (DGC)	基于浮力密度差異，在蔗糖等梯度介質(zhì)中分離EVs	可分離密度相近的顆粒	可能共分離密度相似的非EV顆粒；導(dǎo)致EVs損失和損傷
尺寸排阻色譜法 (SEC)	依據(jù)分子尺寸分離，大分子EVs先于小分子蛋白洗脫	操作溫和，保留囊泡完整性	無(wú)法排除非EV物質(zhì)；洗脫液稀釋需額外濃縮步驟；需合并多組分
超濾法	通過(guò)膜孔徑截留大尺寸EVs	快速、可處理大體積樣本	存在外泌體形變風(fēng)險(xiǎn)；小分子流體成分易污染樣本
聚合物沉淀法	體積排阻聚合物（如PEG）沉淀EVs及相似尺寸顆粒，低速離心收集	操作簡(jiǎn)單，適合臨床轉(zhuǎn)化	蛋白去除率低，存在蛋白污染風(fēng)險(xiǎn)
免疫親和純化法	抗體靶向捕獲特定表面標(biāo)志物（如CD63）的EV亞群	特異性與純度高	耗時(shí)長(zhǎng)、成本高（需延長(zhǎng)抗原-抗體結(jié)合時(shí)間）；試劑質(zhì)量要求嚴(yán)格；僅獲特定EV亞群

8、細(xì)胞外囊泡的存儲(chǔ)

儲(chǔ)存條件對(duì)于維持MSC條件培養(yǎng)基中EV的特性至關(guān)重要，包括其穩(wěn)定性、顆粒數(shù)、聚集性和功能性。對(duì)于MSC條件培養(yǎng)基和分離的EV，提供其儲(chǔ)存方式的具體細(xì)節(jié)（包括所用容器類型、儲(chǔ)存溫度和儲(chǔ)存時(shí)間）至關(guān)重要。在儲(chǔ)存過(guò)程中，主要問(wèn)題之一是高純度EV的損失，這可能是由于它們粘附在儲(chǔ)存容器表面造成的。

目前，?80°C被認(rèn)為是MSC條件培養(yǎng)基和分離的EV的最佳儲(chǔ)存溫度。然而，一些研究表明，在此溫度下儲(chǔ)存會(huì)導(dǎo)致EV特性隨時(shí)間發(fā)生變化。無(wú)論使用防腐劑還是冷凍保護(hù)劑，在?80°C下儲(chǔ)存均已證實(shí)會(huì)降低EV濃度和純度，并改變粒度和zeta電位。此外，建議避免反復(fù)凍融循環(huán)，因?yàn)檫@會(huì)對(duì)EV質(zhì)量產(chǎn)生潛在的有害影響。

9、結(jié)論

EV分類學(xué)的演變與挑戰(zhàn)

歷史上，EVs 被稱為不同囊泡的組合，包括外泌體（小型 EVs）、微囊泡（大型 EVs）和外泌體（小型/大型 EVs）。早期研究經(jīng)常互換使用這些術(shù)語(yǔ)。然而，最近的進(jìn)展使得這些 EVs 之間的區(qū)別更加清晰，關(guān)注的是它們的物理特性，而不僅僅是它們的生物發(fā)生機(jī)制。雖然基于大小的分類很實(shí)用，但它并不總是能準(zhǔn)確區(qū)分 EVs 的類型，例如微囊泡和外泌體。迄今為止，創(chuàng)新技術(shù)能夠在復(fù)雜混合物中識(shí)別和表征 EVs 亞型。為了準(zhǔn)確分類，這種方法需要考慮多種特征，包括表面標(biāo)志和大小，強(qiáng)調(diào)詳細(xì)特征而不是簡(jiǎn)單的測(cè)量指標(biāo)，例如大小。

胞外囊泡（EV）是細(xì)胞間運(yùn)輸關(guān)鍵物質(zhì)（蛋白質(zhì)、RNA、脂質(zhì)和碳水化合物）的重要信使，其成分主要與來(lái)源細(xì)胞相似。越來(lái)越多的研究表明，MSC-EV 具有與 MSC 類似的功能，參與 MSC 的旁分泌信號(hào)傳導(dǎo)，可能有助于其他干細(xì)胞的進(jìn)展和分化，促進(jìn)組織再生，并發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。

MSC-EVs的治療優(yōu)勢(shì)與產(chǎn)業(yè)化瓶頸

與目前的細(xì)胞方法相比，MSC-EVs更易于管理、更具成本效益，且易于大規(guī)模生產(chǎn)。然而，其作為一種更優(yōu)的臨床治療策略的發(fā)展受到諸多挑戰(zhàn)的阻礙。MSC-EVs在體外和體內(nèi)研究中的標(biāo)準(zhǔn)化應(yīng)用仍然不足，阻礙了臨床試驗(yàn)的開展。不同研究方法的不一致影響了可比性，需要建立可重復(fù)的EVs純化和表征技術(shù)。

治療屬性	產(chǎn)業(yè)化挑戰(zhàn)
繼承MSCs旁分泌功能：促進(jìn)干細(xì)胞分化、組織再生與免疫調(diào)節(jié)	標(biāo)準(zhǔn)化缺失：分離/表征方法不統(tǒng)一阻礙臨床試驗(yàn)
無(wú)細(xì)胞治療優(yōu)勢(shì)：易儲(chǔ)存運(yùn)輸、無(wú)免疫排斥、無(wú)倫理爭(zhēng)議	規(guī)模化生產(chǎn)瓶頸：缺乏符合GMP標(biāo)準(zhǔn)的量產(chǎn)工藝
工程化潛力：可修飾增強(qiáng)靶向性	藥效學(xué)盲區(qū)：靶向機(jī)制與藥代動(dòng)力學(xué)不明

臨床轉(zhuǎn)化路徑與未來(lái)方向

MSC-EVs作為治療手段的應(yīng)用與MSCs大規(guī)模培養(yǎng)和臨床應(yīng)用的進(jìn)展密切相關(guān)，展現(xiàn)出巨大的治療前景。MSC-EVs 具有諸多優(yōu)勢(shì)，包括易于儲(chǔ)存和運(yùn)輸、保質(zhì)期更長(zhǎng)、免疫排斥風(fēng)險(xiǎn)更低以及比細(xì)胞療法更少的倫理問(wèn)題。然而，其臨床應(yīng)用仍需解決幾個(gè)關(guān)鍵問(wèn)題，包括開發(fā)大規(guī)模生產(chǎn)方法、實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)定量和表征、了解其藥代動(dòng)力學(xué)和靶向機(jī)制以及全面評(píng)估其安全性。

未來(lái)的關(guān)鍵方向之一是標(biāo)準(zhǔn)化和可擴(kuò)展的EVs生產(chǎn)工藝，以優(yōu)化功能和儲(chǔ)存條件。此外，提高EVs的分離效率和選擇性也至關(guān)重要。TFF已成為一種備受青睞的首選方法，與免疫沉淀和密度梯度離心 (UC) 等傳統(tǒng)技術(shù)相比，它具有可擴(kuò)展性和可靠性。進(jìn)一步的研究還將探討環(huán)境條件和工程設(shè)計(jì)如何影響MSC-EVs的功能，從而增強(qiáng)其在再生醫(yī)學(xué)中的治療效果。盡管MSC-EV療法具有巨大的潛力，但擴(kuò)大GMP級(jí)EV藥物的生產(chǎn)和開展全面的臨床試驗(yàn)仍然面臨重大挑戰(zhàn)。

參考資料：[1]Huang, CY. (2025). Biology of Extracellular Vesicles from Mesenchymal Stem Cells. In: Liem, N.T., Forsyth, N.R., Heke, M. (eds) Cell Therapy. Springer, Singapore. https://doi.org/10.1007/978-981-96-1261-1_6

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